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一文了解靶向組學研究中的靶標-（附代謝組學、蛋白組學、糖組學案例，建議收藏)
組學研究中的靶標
-同位素標記(建議收藏)
? ? ? ?組學研究是對生物體各類代謝過程及代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式 。作為組學研究常用的檢測方法，質譜 (MS) 和核磁 (NMR) 可以檢測機體某一特定時刻代謝物在體內完成復雜代謝后的總量，而無法精確到代謝物所處的具體代謝通路。
? ? ? 目前，可通過在組學分析中引入放射或穩定同位素標記物示蹤劑去推斷其代謝路徑。但放射性同位素對人體有一定危害，穩定同位素無放射性、物理性質穩定、對人體無害，因此更受科研人員的歡迎。穩定同位素標記也成為組學研究中最常用的靶標（代謝組學、蛋白質組學、脂質組學、糖組學。。。）
01
代謝組學 （Metabolomics）
? ? ? ?效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想，對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，是系統生物學的組成部分。其研究對象大都是相對分子質量1000以內的小分子物質。先進分析檢測技術結合模式識別和專家系統等計算分析方法是代謝組學研究的基本方法。
? ? ? 【研究案例】通過質譜測定，跟蹤穩定同位素示蹤劑的代謝物標記可以揭示其代謝途徑。
? ? ? ? G. D. Marijn Veerman 等人，用 100 ng/mL 的含氘同位素 (afatinib-d6, crizotinib -d5 and erlotinib-d6) 產品做內標，僅在 5 分鐘時間就可以測定人血漿中所有化合物? (如 Afatinib，Alectinib，Crizotinib 和 Osimertinib) 的濃度范圍，該方法有潛力用于臨床前的藥代動力學研究。
? ? 【研究案例】冠狀動脈疾病(CAD)對精氨酸/一氧化氮(Arg/NO)途徑的影響仍在繼續研究中。為了加強對該領域的理解，Banfi和同事們開發了一種靶向MS代謝組學方法來量化人類血漿中的Arg/NO途徑代謝物。該方法使用了一系列穩定的同位素標記標準(如13C7/15N4 L-同型精氨酸，D6鳥氨酸)，根據FDA指南進行了驗證，并應用于不同級別/類型CAD的患者樣本。盡管還需要更大的研究隊列，但有意義的發現表明Arg/NO代謝物與急性心血管事件之間存在性別依賴的相關性。
02
蛋白質組學 (Proteomics)
? ? ? ?過去十年來，質譜（MS）已經成為蛋白質組學研究的基礎，是生物學家進行蛋白質組學研究的必不可少的工具。質譜儀具有從復雜的生物樣品中鑒別出成千上萬種蛋白質的能力，從而使科學實驗發生了革命性的變化。在許多疾病的發展進程中(如癌癥)，常伴隨著某些蛋白質的表達異常。蛋白質組學就是把一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜的混合體系中所有的蛋白質進行精確的定量和鑒定。穩定同位素標記的方法，可以量化樣品中的蛋白質濃度差異。因此同位素標記可用于對癌癥生物標志物檢測、鑒定和驗證等。
? ? ?【研究案例】美國賓夕法尼亞大學藥學系 Matthew L.MacDonald,Eugene Ciccimaro,Ian Blair,Chang-Gyu Hahn靶向LC-SRM/MS定量哺乳動物突觸蛋白Mouse Express?腦組織。使用一種LC-SRM/MS反應監測方法，該方法利用CIL公司的Mouse Express?腦組織L-賴氨酸(13C6,97%)對哺乳動物腦組織亞細胞部分中的突觸肽進行靶向定量。該方法利用SILAM腦勻漿的膜制劑作為內部標準，促進了從小鼠腦組織分離的三個神經元亞組分(囊泡、突觸前和突觸后密度)的100多種蛋白的定量。
? ? ? 【研究案例】法國蒙彼利埃大學Audrey Sirvent, Serge Urbach, Serge Roche利用穩定同位素氨基酸Mouse Express?Lysine-13C6小鼠異種移植物實驗分析人類癌癥中的酪氨酸激酶信號。文中描述了一種新的蛋白質組學方法，使用Mouse Express?L-賴氨酸(13C6, 99%)小鼠飼料對人癌細胞異種移植的裸鼠腫瘤進行標記(MF-LYS-C)。腫瘤中發生的高從頭合成蛋白率可能會在短時間內誘導異種移植腫瘤的高效標記。通過只給植入的小鼠喂食SILAC小鼠飼料，我們觀察到一致的>88%的腫瘤蛋白組標記30天。然后使用這種方法來比較SRC陽性腫瘤。
? ? ?【研究案例】穩定同位素示蹤技術通常用于研究人類蛋白質代謝、生理和疾病。為了克服示蹤劑輸注方法的局限性，Hirsch和Church等人開發了一種口服“小口喂養”方法來量化全身蛋白質動力學的急性變化。使用sip劑量的穩定同位素標記氨基酸(如D5 L-苯丙氨酸，D2 L-酪氨酸)，測定了一段時間內人類血漿中蛋白質合成和分解的速率。這項初步研究證明了對全身蛋白質代謝的可靠測量，以及作為傳統輸注示蹤技術的潛在替代方案的可行性。
? ?? ?【研究案例】穩定同位素標記的氨基酸在細胞培養（SILAC）方面就是一個很好的例子，該方法完美的將同位素標記與蛋白質結合，以便用質譜來研究蛋白質組學。在SILAC實驗中，兩種細胞生長在培養基中，其中一個有“輕氨基酸”（自然豐度），另一個是重氨基酸（同位素標記）（例如，未標記和L-賴氨酸·2HCl（13C6，99%）（CIL目錄號CLM-2247）和L-精氨酸·HCl（13C6，99%）（CIL目錄號CLM2265））。同位素標記的氨基酸代替了細胞培養中使用的天然氨基酸與所有新合成的蛋白質結合。在細胞分裂過程中，每一個特定的氨基酸都被對應的同位素標記氨基酸替代。這種方法的優勢是兩種細胞裂解后立即混合在一起，因此來自這兩種細胞類型的蛋白質在相同的樣品處理過程中的消化、純化和分離步驟的實驗條件完全相同。因為這個原因，SILAC通常被認為是蛋白質組學定量的金標準。
? ? 【研究案例】蛋白質組學是研究人類疾病中失調的蛋白質和翻譯后修飾(PTM)的重要工具。小鼠模型是體內模擬人類疾病的主要手段.哺乳動物的穩定同位素標記(SILAM)是一種金標準定量方法。在SILAM中，對照小鼠被喂食同位素標記的氨基酸以產生重蛋白質樣本。標記的參考樣品與未標記的樣品等量混合，并使用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)進行定量。SILAM可以在大動態范圍內進行準確定量，而不會受到等壓標記中出現的比率壓縮的影響。此外，與其他方法相比，SILAM可產生更多的標記蛋白，并允許在消化和富集之前混合樣品，從而有助于對低豐度分析物進行準確定量。
? ? ? 在生物標志物篩選中，大規模的蛋白質定量應用于蛋白質組學領域，發現并驗證疾病指標。這些檢測指標通常用液相色譜(LC)-串聯質譜(MS/MS)對血漿樣本進行。為了協助研究人員的開發和應用，劍橋同位素實驗室公司(CIL)提供PeptiQuant“Plus生物標志物評估試劑盒(BAKs)，用于血漿蛋白的LC-MS/MS檢測。
03
脂質組學（Lipidomics）
? ? ? ?脂質是普遍存在的分子，服務于多種重要的生物功能，包括能量儲存（甘油三酯）、細胞膜結構和功能的調節(磷脂和膽固醇）、細胞內信號和激素調節。脂質組學即系統研究細胞、組織或生物體內所有脂質的學科。主要研究數千種脂質的類型、分布、功能、與其他生物分子的相互作用，以及它們在生理代謝、病理狀態時的動態變化。涉及的分析技術包括脂質的提取、分離、液相層析、各種質譜、核磁共振波譜、熒光光譜等。對深入研究各種脂質在生物膜結構、能量轉換、信號轉導等方面有重要意義，同時在臨床檢驗、疾病診斷領域也有應用價值。
? ? ? ?脂質代謝異常可導致多種疾病，包括動脈粥樣硬化、高甘油三酯血癥和2型糖尿病。因此，了解脂質在體內的合成、調節和運輸對于開發和改進新的治療方法非常重要。穩定同位素已被用于研究脂質代謝的幾個方面，包括：膽固醇、磷脂、低密度脂蛋白甘油三酯的合成與處理。
? ???【研究案例】脂類合成的實驗，使用穩定同位素標記的脂肪酸作為底物來研究小鼠體內脂質代謝的一些優點和實驗思路。C57BL6小鼠用溶媒對照和全身性小分子微粒體甘油三酯轉移蛋白（MTP）抑制劑治療。一小時后，給小鼠注射150 mg/kg油酸、鉀鹽（13C18，98%）CP 95%（CLM-8856）和玉米油（圖2）或20%TPGS（圖3）。在給藥示蹤劑后的連續時間點提取血樣并處理成血漿。將10μL血漿與90μL標記內標物的甲醇溶液混合，并用300μL戊醇進一步稀釋。將樣品短暫離心至顆粒不溶性蛋白質，并通過超高效液相色譜（與三重四極（Waters Xevo TQ）或四極飛行時間（Waters Synapt G2）質譜儀連接）分析5-10μL上清液。實驗中，其中一種脂肪酸是全氘化棕櫚酸(D31, 98%) (DLM-215)、硬脂酸(D35, 98%) (DLM-379)、油酸(D33, 98%) (DLM-1891)，其余兩種是未標記的，或者三種脂肪酸都是全氘化的。將10μL血漿與丙酮在堿性pH下培養，以將血漿水中的氘與丙酮交換。然后用頂空氣相色譜法結合同位素比值質譜儀（Thermo-Scientific）測量丙酮中氘的富集。
04
糖組學 (Glycomics)
? ? ? 糖基化是真核系統中最常見的蛋白質表達修飾之一。據估計60-90%的哺乳動物蛋白是糖基化的，事實上所有膜和分泌蛋白也是糖基化的。糖蛋白在生理代謝中通常起關鍵作用，例如細胞識別，信號傳導，炎癥和癌變。鑒于蛋白質糖基化的重要生理作用，眾多研究團隊致力于特異性聚糖的結構鑒定，表達蛋白的聚糖，以及對這些結構如何變化的詳細研究，例如細胞分化或隨著腫瘤細胞的發展。所有這些努力發展出了新的研究領域--糖組學。
? ? ?【研究案例】用同位素標記糖可以讓聚糖的細微變化可視化，可以比較每個生物樣品中的精細結構。以 Comparative glycomics using a tetraplex stable-isotope coded tag 一文為例， Michael J. Bowman 等人使用四重穩定同位素編碼標簽，通過正相毛細管 LC-MS 和納噴霧質譜，可直接在四個樣品中直接比較其多糖組成。這證明了穩定同位素標記方法對于高質量的糖組學組成譜和精細結構分析的應用價值。
? ? 【研究案例】糖組學的一種體內標記的方法，這種方法類似于SILAC在蛋白質組學領域的應用。這種糖組學方法叫做IDAWG -（谷氨酰胺對氨基糖的同位素檢測）-這基于谷氨酰胺側鏈是氨基糖核苷酸合成中唯一的氮供體（圖一）。因此，將L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）引入不含谷氨酰胺的培養基中，可產生N15標記的包括乙酰氨基葡萄糖、乙酰半乳糖胺和唾液酸在內的所有氨基糖類。這導致每個含N和O的聚糖、糖脂和胞外基質多糖的質量數增加+1Da。該方法通過培養在未標記和N15標記的谷氨酰胺環境中的小鼠胚胎干細胞蛋白質釋放含N聚糖的實驗得到了驗證。這些實驗的成功使我們預測，未來IDAWG技術將有助于細胞培養方面各種比較糖組學的研究。
Q
【不懂就問】為什么氨基酸都是L型的？
? ? ? ?在生物進化過程中,氨基酸自然選擇為L型,糖類自然選擇為D型,沒有理由.只能認為在生物進化過程中,與酶的活性中心構型相配的,氨基酸只能是L型才相配.糖類只能是D型才相配.也許最初的生物也曾能夠利用D型氨基酸或L型糖,但選擇利用L型氨基酸和D型糖的生物在進化中成為優勢物種,于是能夠利用D型氨基酸或L型糖的生物慢慢地消失了,只剩下能夠利用L型氨基酸和D型糖的生物,于是就成了現在這個樣子。
