分析測試百科網 > 行業資訊 > 微信文章

蛋白質組學專題 | 蛋白質組學樣品前處理之蛋白提取

邁維代謝

2022.11.24

在公眾號的第二系列推文《蛋白質組學專題 | 一文讀懂蛋白質組學研究策略及研究內容》中提到，蛋白質組學技術一般包括樣本預處理、蛋白酶解除鹽、質譜檢測和數據分析。其中樣本預處理是整個蛋白質組學方法步驟的第一環，也是決定后續步驟能否順利進行的重要環節。因此，樣本預處理的好壞直接關乎到實驗能否成功。今天我們就來聊一聊樣本預處理的那些事。

樣本預處理就是用一系列的手段和方法，從樣本中提取蛋白，并處理成可用于質譜上機的肽段混合物的整個過程。包括蛋白提取、定量、還原烷基化、酶解、除鹽等，有些蛋白質組學方法還包括標記、富集、HPLC分級等流程。

■?■?■?■?■

圖1 蛋白質組學實驗流程

在講蛋白質組學樣本前處理之前，我們來看下為什么樣本前處理比較重要。

收取樣本之后，經過前處理得到蛋白，拿到處理好的蛋白樣品以后，我們將樣品酶解成肽段，然后質譜上機得到一級譜圖，再由母離子肽段與惰性氣體碰撞生成碎片離子，得到二級譜圖。然后我們用質譜產生的譜圖與樣本物種所對應的數據庫理論譜圖進行匹配，從而判斷肽段的氨基酸組成，然后再根據肽段反推出蛋白質（如圖二所示）。所以，對于每個蛋白質來說，能夠匹配上的實際譜圖越多，這個蛋白的鑒定結果就越可信。

■?■?■?■?■

圖2 譜圖與肽段和蛋白的匹配

那么如何提高蛋白質組學鑒定的深度和準確性呢？從質譜層面來來講，就是需要提高譜圖數，提高肽段匹配率，提高蛋白鑒定的準確性。要滿足上面的三個要求，這就需要我們在前處理上需要在保證提取蛋白的完整性的前提下，盡可能的提取出樣本中所含有的蛋白，同時盡可能的減少實驗誤差。

既然蛋白質組學對前處理提出了要求，那么我們再來看下前處理到底可以分為那些部分。樣本前處理的步驟包括樣本收集與保存、樣本破碎、樣本蛋白提取、還原烷基化、蛋白酶解以及除鹽。其中樣本收集與保存、樣本破碎、樣本蛋白提取在很大程度上決定了樣本前處理的效果。

接下來圍繞這三個方面，我們來看看樣本前處理那些事兒。

PART

樣品的收集與保存

樣本預處理之前，需要先收集和保存樣品。如果收集的方法或者保存的方式不得當，就會嚴重影響后面的預處理步驟以及實驗結果！

一般來說，對于組織樣本通常用PBS清洗然后液氮速凍，-80℃保存，寄樣時用干冰運輸。有條件的建議用灌流的方式來去血，然后液氮速凍保存。對于植物樣本，先用清水清洗植物表面灰塵，然后用無塵紙拭干水分，液氮速凍，-80℃保存，寄樣時用干冰運輸。對于細胞類樣品：細胞取好后，也需要用PBS清洗一下細胞表面，去除可能含有的血清和胰蛋白酶。此外，還有一些其他的樣本收集方法，詳細請參考我們公司發布的樣本收集手冊。

總之，樣本的收集上要盡可能去除對后續組學實驗能造成影響的雜質，保持收集樣本之間的均一性，同時也需要盡可能的避免樣本蛋白蛋白的降解。

PART

樣品破碎的方法主要分三類

1.?機械碎裂：通過機械手段，進行樣本破碎

●勻漿：一般適用于亞細胞器的破碎或者一些軟組織，如肝臟樣本的前處理。目前組織勻漿的方法比較多，手持式勻漿器由于其高效、簡單的性能被廣泛運用。

●液氮研磨：液氮研磨是蛋白質祖學樣本前處理最金典的樣本破碎方法，適用于大部分組織樣品，比如常見的胃臟樣品、腸樣品、肝臟樣品、植物組織樣本等。對于植物樣本、革蘭氏陽性菌等研磨尤其重要，研磨破碎效果直接影響項目質譜鑒定的深度和準確性。

●搗碎法：用研磨的方法破碎樣品，如果樣品數多，那可是件非常辛苦的事情！于是一些公司推出了組織研磨儀，利用玻璃珠或者磁珠劇烈地震蕩，或者用刀片高速旋轉，幫助我們做樣品破碎。雖然，在一定程度上是提高了效率，但是局限性也很大，對硬度比較高的組織樣本破碎效果很差，如癌癥組織，皮膚組織等；對樣本量較少的樣本損失量較大。此外，由于劇烈震蕩會產生大量的熱，在一定程度上會導致蛋白降解。

■?■?■?■?■

圖3 常見的樣本破碎方法

2.?物理破碎：靠足夠大的溫差、壓力差等方法，導致細胞膜破裂

●溫差法：通常用于細胞樣本破碎，利用高溫和低溫的反復變化，破壞細胞膜，從而釋放蛋白。

●壓力差法：適用于組織樣品，通過高壓和低壓的反復變化，實現對組織樣品的破碎，

●化學處理法：使用各種化學試劑等，破碎細胞的膜結構，導致細胞的破碎。如EDTA，離子表面活性劑等。

PART

樣本蛋白的提取

說到樣本蛋白提取，就不得不提到目前常用的幾種蛋白裂解液以及各種裂解液的處理方法和優缺點。在蛋白提取中，我們常用的蛋白提取裂解液有8M尿素、SDS、SDC、RIPA、酚提取液等等。

上面列出的一些重要的試劑，我們來詳細聊一聊這些裂解液：

? 8M尿素：這是一種比較強的變性劑，能提取大多數樣本中的蛋白質。對各類蛋白質提取能力比較均衡，無明顯偏好性，且尿素與BCA定量試劑盒兼容，不需要額外步驟去除，在樣本的前處理中運用的比較常見。

需要注意的是，尿素受熱易分解，當溫度超過37℃后，尿素分子會降解使蛋白的氨基胍基化，從而影響蛋白質的理化性質，還有可能會影響酶解效果以及后續數據檢索！此外，8M尿素會讓胰酶也變性，失去活性，胰酶酶解時要將尿素稀釋到1M以下。

??SDS：是一種裂解能力很強的裂解液，能提取樣本中的絕大部分蛋白。由于其超強的裂解能力，能處理的樣本類型比較多，包括動物、植物、細胞樣本都能用SDS裂解。

SDS裂解液的劣勢在于在提取蛋白的同時也會提取一些非蛋白成分，造成提出來的蛋白比較臟，質譜譜圖背景比較高，在一定程度上會影響蛋白鑒定。另外，SDS與胰酶不兼容，也不與質譜兼容，而且常規的方法比較難以去除，需要用到有機試劑沉淀（如丙酮沉淀），操作步驟比較繁瑣。雖然SDS裂解有諸多好處，但一般實驗室中運用的比較謹慎。

??SDC：也是一種較強的裂解液，常與TCEP和IAA連用，用于蛋白的提取酶解和還原烷基化。由于SDC在低濃度下對酶的活性影響很小，且在酸性條件下能夠沉淀析出的特性，能將蛋白質組學前處理的步驟集成化，大大的縮短了前處理的時間，提高效率。但是,SDC裂解蛋白中需要用到高溫加熱步驟，可能會造成蛋白修飾破壞，因此該方法不適合用于修飾組學的樣本蛋白提取。

??RIPA裂解液：是一種傳統的細胞、動物組織快速裂解液,分為弱、中、強三類。該裂解液提取的蛋白有生物活性，可用于IP等實驗，且該類試劑對膜蛋白的提取有偏好性；缺點是含有去污劑與質譜不兼容，需要沉淀去除，實驗步驟多，且對植物蛋白提取能力較弱，適用范圍局限性較大。

??酚提取試劑：是一種強蛋白提取液，對大多數樣本都有比較好的提取效果，一般常用做對頑固植物組織樣本的蛋白提取，如植物根、莖等組織部位。由于提取中需要用到苯酚、丙酮等有毒的有試劑，在實驗中需謹慎使用，此外，該方法提取蛋白實驗流程比較繁瑣，增加了實驗誤差，這些因素都限制了該方法的運用。

總的來說，各類樣本破碎方法、蛋白裂解液在前處理中都有自己的優勢和缺點，實際操作中，我們通常會將幾種方法結合起來使用。比如先液氨研磨，結合比較強的變性劑的方法，再加上超聲的方法，來提取樣本中的蛋白，以達到充分獲取樣本中蛋白的目的。

最后，需要提一下耗材的問題。整個處理過程中，所有使用的EP管、槍頭、裝試劑的塑料瓶，含有大量的聚乙二醇，而聚乙二醇非常容易離子化，會在質譜中形成很強的塑料峰，甚至會完全掩蓋目標肽段的峰，影響蛋白質組學質譜檢測，甚至導致檢測的失敗。故，實驗中也需要考慮耗材對實驗造成的影響，選擇合適的耗材進行蛋白質組學實驗。

ART

科研延伸

（1）邁維4D蛋白質組學

●蛋白質檢出數量多、樣本檢出穩定性高

●定性重復性高，更準確