【阿拉丁】Caspase免疫熒光染色方案
Caspase免疫熒光染色方案
? ? ? ? ?細胞凋亡是一種受嚴格調控的細胞死亡機制,其核心是半胱天冬酶(Caspase)的激活。免疫熒光染色是一種有效的技術,可以同時檢測細胞樣本中的半胱天冬酶和其他凋亡相關蛋白。
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? ? ? ? 該實驗方案用于一般性指南。對于具體的實驗,需要根據所用樣品和抗體進行優化。
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常規流程
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所需材料
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? ? ? ? ? -針對caspase的一抗,例如重組Caspase-3抗體,兔抗(Ab093013)
? ? ? ? ? -準備好樣本并固定在載玻片上
? ? ? ? ? - Triton X-100
? ? ? ? ? - PBS
? ? ? ? ? -封閉緩沖液(PBS/0.1%Tween 20 + 5%血清)
? ? ? ? ? -結合二抗,例如山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor? 488)(Ab138205)
? ? ? ? ? -封固劑
? ? ? ? ? -加濕室
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實驗步驟
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1.將固定的樣品在PBS/0.1% Triton X-100中室溫孵育5分鐘,進行透膜處理。
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2.用PBS清洗三次,每次在室溫下放置5分鐘。
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3.吸干載玻片并加入200 μL封閉緩沖液(PBS/0.1% Tween 20 + 5%血清)。
? ? ? ? ? 3.1將載玻片平放在加濕室中并在室溫下孵育1-2小時。
? ? ? ? ? 3.2然后用PBS沖洗一次。
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? ? ? ? ? 注意:我們建議使用來自二抗宿主物種(或密切相關物種)的血清,例如,如果使用山羊抗兔結合物,則在封閉緩沖液中使用山羊血清。
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4.加入100 μL在封閉緩沖液中以1:200稀釋的一抗。然后將載玻片放在加濕箱中,在4°C下孵育過夜。
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? ? ? ? ? 提示:您可以準備不含一抗的載玻片作為陰性對照。
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5.第二天,室溫下用 PBS/0.1% Tween 20 清洗載玻片三次,每次10分鐘。
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6.吸干載玻片并加入100 μL適當的二抗(在PBS中按1:500稀釋)。
? ? ? ? ? 6.1將載玻片平放在加濕室中,避光,室溫下孵育1-2小時。
? ? ? ? ? 6.2用PBS/0.1% Tween 20 清洗三次,每次5分鐘,避光。
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7.瀝干液體,將載玻片封固在永久性或水性封固劑中,并用熒光顯微鏡觀察。
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應用
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1)細胞凋亡研究:?研究細胞凋亡過程中caspases的激活狀態,了解細胞死亡的分子機制。
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2)藥物篩選和毒性測試:?評估藥物或化合物對細胞凋亡的影響,并篩選誘導或抑制細胞凋亡活性的候選藥物。
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3)細胞信號轉導研究:?研究細胞信號通路影響caspases的活化及細胞凋亡的過程。
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4)發育生物學:?研究caspases在胚胎發育和組織形態發生過程中程序性細胞死亡中的作用。
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5)免疫學研究:?研究caspases在T細胞、B細胞等免疫細胞中對免疫反應的調控作用。
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