維生素C測定：熒光法
1．原理樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成具有熒光的喹喔啉（quinoxaline）,其熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定食物中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。脫氫抗壞血酸與硼酸可形成復(fù)合物而不與OPDA反應(yīng)，以此排除樣品中熒光雜質(zhì)所產(chǎn)生的干擾。本方法的最小檢出限為0.022g/ml。
2．適用范圍GB12392-90本方法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定
3．儀器3．1．實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。3．2．熒光分光光度計(jì)或具有350nm及430nm波長的熒光計(jì)。3．3．打碎機(jī)。
4．試劑本實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，試劑不加說明均為分析純試劑。（1）偏磷酸－乙酸液：稱取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，攪拌，放置過夜使之逐漸溶解，加水至500ml。4℃冰箱可保存7～10天。（2）0.15mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀釋至1200ml。（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液為稀釋液，其余同4.1.配制。（4）50%乙酸鈉溶液：稱取500g乙酸鈉（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。（5）硼酸-乙酸鈉溶液：稱取3g硼酸，溶于100ml乙酸鈉溶液（4.4）中。臨用前配制。（6）鄰苯二胺溶液：稱取20mg鄰苯二胺，于臨用前用水稀釋至100ml。（7）0.04%百里酚藍(lán)指示劑溶液：稱取0.1g百里酚藍(lán)，加0.02mol/L氫氧化鈉溶液，在玻璃研缽中研磨至溶解，氫氧化鈉的用量約為10.75ml，磨溶后用水稀釋至250ml。變色范圍：pH=1.2紅色pH=2.8黃色pH>4.0蘭色（8）活性炭的活化：加200g炭粉于1L1+9鹽酸中，加熱回流1~2h，過濾，用水洗至濾液中無鐵離子為止，置于110~120℃烘箱中干燥，備用。（9）標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/ml）：準(zhǔn)確稱取50mg抗壞血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀釋至刻度。抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液（100μg/ml）:取10ml抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml。定容前試pH值，如其pH>2.2時(shí)，則應(yīng)用溶液（4.3）稀釋。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取下述"標(biāo)準(zhǔn)"溶液（抗壞血酸含量10μg/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml標(biāo)準(zhǔn)系列，取雙份分別置于10ml帶蓋試管中，再用水補(bǔ)充至2.0ml。
5.操作步驟5.1樣品制備全部實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)避光。稱取100g鮮樣，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎機(jī)內(nèi)打成勻漿，用百里酚藍(lán)指示劑調(diào)試勻漿酸堿度。如呈紅色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀釋，若呈黃色或蘭色，則用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋，使其pH為1.2。勻漿的取量需根據(jù)樣品中抗壞血酸的含量而定。當(dāng)樣品液含量在40~100μg/ml之間，一般取20g勻漿，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml，過濾，濾液備用。5.2氧化處理：分別取樣品濾液及標(biāo)準(zhǔn)使用液各100ml于帶蓋三角瓶中，加2g活性炭，用力振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液，分別收集其余全部濾液，即樣品氧化液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測定。5.3各取5ml標(biāo)準(zhǔn)氧化液于2個(gè)50ml容量瓶中，分別標(biāo)明"標(biāo)準(zhǔn)"及"標(biāo)準(zhǔn)空白"。5.4各取5ml樣品氧化液于2個(gè)50ml容量瓶中，分別標(biāo)明"樣品"及"樣品空白"。5.5于"標(biāo)準(zhǔn)空白"及"樣品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸鈉溶液，混合搖動(dòng)15min，用水稀釋至50ml，在4℃冰箱中放置2h，取出備用。5.6于"樣品"及"標(biāo)準(zhǔn)"溶液中各加入5ml50%乙酸鈉溶液，用水稀釋至50ml，備用。5.7熒光反應(yīng)取"標(biāo)準(zhǔn)空白"溶液，"樣品空白"溶液及（5.6）中"樣品"溶液各2ml，分別置于10ml帶蓋試管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml鄰苯二胺，振搖混合，在室溫下反應(yīng)35min，用激發(fā)光波長338nm、發(fā)射光波長420nm測定熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的抗壞血酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，其直線回歸方程供計(jì)算時(shí)使用。
6.計(jì)算X=（c×V/m）×F×(100/1000)式中：X-----樣品中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，mg/100g；c------由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得樣品溶液濃度，μg/ml；m-----試樣質(zhì)量，g；F------樣品溶液的稀釋倍數(shù)；V------熒光反應(yīng)所用試樣體積，ml。例：測定每一制備溶液的熒光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg，各標(biāo)準(zhǔn)濃度管讀數(shù)減去相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)空白讀數(shù)的各平均值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由樣品液讀數(shù)減去樣品液空白讀數(shù)之值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的抗壞血酸（μg/ml），按取樣量及稀釋率計(jì)算樣品中抗壞血酸的含量。如：取制備好的辣椒樣品2.138g，稀釋到100ml，氧化后分別取10ml濾液稀釋到50ml樣品讀數(shù)為23.34，樣品空白讀數(shù)為3.188，樣品讀數(shù)減去樣品空白讀數(shù)為20.152，查熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸的2.23μg。2.23×100×50×100 ? =52（mg/100g）2.138×10×1000
7.注意事項(xiàng)
7.1大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，因此，抗壞血酸的測定應(yīng)采用新鮮樣品并盡快用偏磷酸-醋酸提取液將樣品制成勻漿以保存維生素C。
7.2某些果膠含量高的樣品不易過濾，可采用抽濾的方法，也可先離心，再取上清液過濾。
7.3活性炭可將抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，但它也有吸附抗壞血酸的作用，故活性炭用量應(yīng)適當(dāng)與準(zhǔn)確，所以，應(yīng)用天平稱量。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用2g活性炭能使測定樣品中還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫型，其吸附影響不明顯。
