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遺傳病與腫瘤的基因診斷

2020.3.10

從DNA水平上尋找確診遺傳病的指標(biāo)或探討遺傳病和腫瘤的病因等方面,已取得很大成績,對產(chǎn)前診斷,早期確診和突變基因攜帶者的檢出等都有重要意義。所用的方法大體有以下幾種。

一、分離基因進行結(jié)構(gòu)分析

利用DNA離體轉(zhuǎn)化,制備探針,制備基因文庫進行篩檢,最后鑒定載體中插入DNA片段的特性等一系列技術(shù),可以設(shè)法分離出目的基因或某一特定的DNA順序。然后通過DNA核苷酸順序分析可以弄清楚某些疾病的病因。

比如,人體癌基因的分離和研究癌基因同原癌基因在DNA的結(jié)構(gòu)與功能上的差別,對了解細(xì)胞癌變的機制起了很大的作用。分離目的基因或?qū)R籇NA順序常用的是制備分子雜交探針,通過Southern印跡雜交或Northern印跡雜交等,了解某些遺傳病基因結(jié)構(gòu)上的差別,從而找到可靠的診斷方法。

比如,患者的基因是否缺失,重排以及是否存在限制性片段長度的多肽現(xiàn)象等。

二、DNA限制性片段多態(tài)性連鎖分析

DNA限制性片段長度多態(tài)性(restricition fragment length polymorphism, RFLPs)連鎖分析法是指由于缺失、重排或堿基置換的結(jié)果,使DNA分子中原有的某種限制性內(nèi)切酶的識別位點發(fā)生改變,或是消失或是增加,所以酶切后生成的DNA片段的長度也隨之改變。這種DNA限制性片段長度的變化往往同某種疾病的連鎖關(guān)系,因而可作為這種疾病的診斷指標(biāo)。

如果所分析的DNA分子不太大,比如人體線粒體DNA,長16569bp。在這種DNA分子上每種限制酶的識別點不過幾到幾十個,因此,當(dāng)某種限制酶的識別點發(fā)生改變并經(jīng)過這種酶切后,可清楚地看到DNA電泳帶的圖型發(fā)生改變,條帶或者增加或是減少,條帶所處的位置也有變化。

可是,遺傳病病例分析時所用的是基因組DNA,而基因組DNA從限制酶酶切后至少會生成100萬個片段,多的可達(dá)1000萬個片段。

如果其中有一、二個片段發(fā)生改變,不可能從電泳凝膠上直接觀察分辨。此時就必定要用合適的探針。某個目的基因或某一特定的DNA片段,在同酶切后的DNA作分子雜交后,可在曝光的X線片上看到RFLP。下圖是用分子雜交法檢測RELP示意圖。

這是通過限制酶A識別點的改變出現(xiàn)DNA的RFLP,再以合適的DNA片段作為分子雜交的探針,在探針上標(biāo)記了放射性同位素,同分別經(jīng)酶A,酶B完全酶切的DNA作印跡雜交。在曝光后的X線片上可看到不同的雜交帶圖型。

①是正常個體,經(jīng)酶A和酶B切后的DNA同探針雜交,都只看到一條帶。

②是一個雜合子即隱性突變基因攜帶者的雜交圖式,由于它的一條染色體的DNA分子中酶A的識別點發(fā)生改變,酶切后的DNA片段較原來的長,所以出現(xiàn)一長一短兩個片段。

③是突變基因純合子,也就是患者,酶A和B的酶切片段雖然是各有一個,但A的片段比正常的個體長,所以雜交帶出現(xiàn)的位置也有改變。

1974年首次用RFLP作為遺傳學(xué)分析的方法。1978年簡悅威和Dozy等第一次用人體β珠蛋白基因作為探針,同限制酶Hpa Ⅰ酶切的DNA做雜交,發(fā)現(xiàn)了DNA的RFLP與鐮形細(xì)胞貧血之間的關(guān)系。

由此可以看出,HpaⅠβ珠蛋白基因13.0kb片段可作為檢出鐮形細(xì)胞貧血及攜帶者的一種指標(biāo)。1981年Geever等根據(jù)鐮形細(xì)胞貧血是β珠蛋白第6個密碼子的一個核苷酸置換的結(jié)果,用限制酶DdeⅠ酶切DNA后與β珠蛋白基因雜交。結(jié)果是:Hb基因型AA的正常個體有175bp和201bp二條帶。

SS個體即患者只有一條帶,是正常人兩個DNA片段長度之和,即376bp。AS雜合子則有三條帶:175bp、201bp、376bp。其原因是第6個密碼子中的A被T置換,使Hb A變成了HbS。限制酶DdeI的識別順序為C↓TNAG,當(dāng)A變成T后,該部位DNA順序變成CTNTG,從而丟失了一個DdeI識別位點,所以HbA的2個DdeI片段(175bp、201bp)變成了HbS的一個DdeI片段(175+201=376bp)。

除了用基因作探針直接檢測基因內(nèi)的核苷酸變化引起的RFLP外,還有兩種途徑:一是用基因作探針,檢測該基因兩側(cè)順序中核苷酸變化引起的RFLP,確定這些RFLP與遺傳病之間有無連鎖關(guān)系。另一種是用克隆的專一DNA順序作探針,檢測基因兩側(cè)順序DNA的RFLP與遺傳病的連鎖關(guān)系。迄今用上述三種方法已查明近30種遺傳病可通過RFLP來檢測。下面列表為部位舉例。

除了遺傳病與RFLP之間的關(guān)系的資料,還發(fā)現(xiàn)人體癌基因Ha-ras的Bam HI片段的長度可在6.75~8.7kb之間變動。種RFLP是由于Ha –ras基因有一段可變串聯(lián)重復(fù)順序(vari-able tandem replication,VTR)。

重復(fù)順序長28bp、重復(fù)次數(shù)可以不同,所以造成BamHⅠ片段的長度變化。圖23-9中左圖箭頭是某種酶的切點,黑框代表可變串聯(lián)重復(fù)順序。

右圖代表某種酶切割后,不同體顯示的電泳圖譜。1/1、2/2、3/3代表1、2、3等位基因的純合子;1/2、1/2、2/3代表三種可能的雜合子,由于重復(fù)順序數(shù)目不同改變了該酶的切點位置,因而形成不同長度的DNA片段。除Ha-ras癌基因外,成人多囊腎(adult polycystic kidney)基因旁也出現(xiàn)VTR,現(xiàn)已用它作攜帶者及產(chǎn)前診斷。

三、聚合酶鏈反應(yīng)

1988年Higuchi等報道,可以從人的單根毛發(fā)的毛囊細(xì)胞中抽提DNA,并結(jié)合運用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù),分析了單根毛發(fā)細(xì)胞中抽提的線粒體DNA的D環(huán)區(qū)(D-loop region)的“DNA”指紋圖”。

PCR技術(shù)由Mullis等首創(chuàng)。它又稱為DNA體外擴增技術(shù),是用DNA聚合酶在體外擴增一段DNA順序達(dá)百萬倍以上。這樣就可直接觀察而不用印跡雜交法。

這項技術(shù)的基本原理是,將有待擴增的DNA分子加熱變性成為單鏈,然后加入按欲擴增DNA片段兩端核苷酸順序合成的一對引物和耐高溫的DNA聚合酶,這樣就可以單鏈DNA分子為模板合成了它的互補鏈。接著再加熱使DNA雙鏈解鏈。

由于這類DNA聚合酶是耐高溫的,所以在熱變性處理后仍保持酶活性,在有引物分子存在的條件下又繼續(xù)合成該DNA片段。如此循環(huán)往復(fù)20~30多個周期,微量的DNA分子可增加10萬~100萬個拷貝。

這種技術(shù)在醫(yī)學(xué)上有很大的用途。先是Saiki等(1985)將其用于鐮形表細(xì)胞性貧血的快速診斷。繼而Chehab等將其用于Barts胎兒水腫綜合征的前診斷(缺失純合型)。我國吳冠蕓、曾溢滔、蔡仕萍、張基增等在不同實驗室將PCR結(jié)合寡核苷酸探針法用于已知點突變的β地中海貧血的產(chǎn)前診斷,并不斷簡化技術(shù)。

PCR技術(shù)已用于許多疾病的診斷及產(chǎn)前診斷(如血友病、假肥大性肌營養(yǎng)不良、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、艾滋病等)。原則上已知DNA順序的基因及突變性質(zhì)的遺傳病都可以應(yīng)用此技術(shù)。此外,PCR還可用于直接做DNA順序分析。


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