熒光偏振法進行高通量 PLpro 抑制劑篩選
COVID-19 的全球傳播是對公共衛(wèi)生的嚴重威脅，有效的治療方法仍然非常有限。因此，新型抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)是抗擊新冠肺炎最為迫切和緊要的任務(wù)。
在 COVID-19 的致病病原體 SARS-CoV-2 的生命周期中，木瓜樣蛋白酶 (PLpro) 在新病毒顆粒的成熟和釋放中起作用，并能抑制 Ⅰ 型干擾素的產(chǎn)生，同時逃避疫苗的免疫。因此，PLpro 被認為是開發(fā)抗病毒藥物的一個非常有吸引力的靶點。阻斷了 PLpro ，這種病毒的產(chǎn)生就會受到抑制，同時人體細胞的先天性免疫反應(yīng)也會增強。
近期皖南醫(yī)學院陳雨云教授帶領(lǐng)的團隊，開發(fā)了一種強大而簡單的三明治狀熒光偏振 (FP) 篩選方法，用于 PLpro 抑制劑的發(fā)現(xiàn)。
通過實驗，該團隊確定了鹽酸是體外靶向 PLpro 的競爭性抑制劑，IC50 值達到 24.26 ±?0.4?μM 。因此，這種強大、簡單、可靠的 FP 篩選方法對于快速篩選靶向 PLpro 的抗病毒藥物至關(guān)重要，并可能為發(fā)現(xiàn)病毒蛋白酶抑制劑提供一個非常有前景的篩選途徑。該項研究成果近期將發(fā)表于 Virology 雜志。
原文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682222001118
三明治篩選結(jié)構(gòu)設(shè)計：
參考該課題組相關(guān)文獻方法報道，研究團隊通過巧妙地設(shè)計，構(gòu)建熒光探針 FITC-S-Biotin （FITC-AVLQSGFRKK-Biotin ，下圖紫紅色虛線）作為 FP 示蹤劑 Tracer ，該 Tracer 具有三明治樣結(jié)構(gòu)：中間包含了 PLpro 蛋白酶（下圖的剪刀）的酶切位點，一端偶聯(lián)了 FITC 熒光探針（下圖綠色圓形），另一端是 Biotin ，可以與蛋白 Avidin （下圖紅色新月形）特異性結(jié)合，形成分子量較大的結(jié)構(gòu)。
當存在活性抑制劑（下圖藍色六邊形）阻斷 Mpro 酶切功能時，未被 Mpro 切割的 Tracer 具有較大的熒光偏振值；當存在 PLpro 蛋白酶及非活性抑制劑（下圖棕色六邊形），Tracer 被切斷，F(xiàn)ITC 端釋放成為小分子，熒光偏振值下降。利用該體系，可篩選具有抑制 PLpro 酶活性的化合物。
該高通量篩選試驗的操作分為 4 個步驟，供實驗室使用。如圖 A 所示，整個過程每輪篩選耗時約 70?min 。首先，將含有 1 個? μM PLpro? (29 μL/孔) 和 1 個天然產(chǎn)物 (2?mg/mL, 1 μL/孔) 的 30?μL 反應(yīng)混合物室溫孵育 30?min ，隨后加入 20?μL FP 探針溶液 (30?nM) ，室溫孵育 30?min ，再用 10?μL 親和素溶液 (240?nM) 進行 5 min 的反應(yīng)，用酶標儀測定 mP 值。
為了快速可靠地篩選天然產(chǎn)物，每個篩選微孔板的排列應(yīng)如圖 B 所示，陽性 (GRL0617) 、陰性 (DMSO) 和背景對照應(yīng)包含在每個篩選周期中。經(jīng)過篩選和驗證，確認鹽酸為 PLpro 的有效抑制劑。然而，anacardiacid具有細胞毒性，需要進一步的化學修飾和結(jié)構(gòu)優(yōu)化來提高其靶標特異性，降低其細胞毒性。
在本研究中，作者首先應(yīng)用 FP 技術(shù)開發(fā)了一種優(yōu)化的三明治狀 FP 篩選方法，用于 PLpro 抑制劑的發(fā)現(xiàn)。該方法在高通量篩選（ HTS） 應(yīng)用中顯示了穩(wěn)定性高、便捷和低成本的優(yōu)勢。
與已發(fā)表的生化分析相比，這種 FP 篩選試驗是非常簡單和快速的，4 步篩選程序每個篩選周期只需要 70?min 。此外，在此 FP 篩選試驗中只使用了微量肽底物 (FP 探針，10 nM/孔) ，與 RFU 信號相比，mP 值的監(jiān)測指標較為穩(wěn)定。因此，該方法具有操作簡單、效率高、重現(xiàn)性好、成本低廉等特點，適用于 HTS 篩選。
此外，由于在此 FP 篩選試驗中 FITC 的發(fā)射波長為 535?nm ，天然產(chǎn)物自身熒光對篩選試驗可靠性的干擾最小。因此，該方法有望獲得可靠的結(jié)果，并將在 PLpro 靶向抗病毒藥物的篩選和評估中具有廣泛的應(yīng)用價值。
◇ FP 小知識：
熒光偏振 (FP) 檢測技術(shù)是一種以熒光標記的檢測技術(shù)，它把熒光物質(zhì)標記在特定物質(zhì)上，使原本微弱的反應(yīng)信號轉(zhuǎn)化成較強的熒光信號，起到信號增強的作用。與此同時，在檢測系統(tǒng)中加上起偏器和檢偏器，當從光源發(fā)出的一束光線經(jīng)垂直起偏器后成為垂直偏振光，樣品被垂直偏振光激發(fā)而產(chǎn)生偏振熒光，此熒光經(jīng)檢偏器后可測出與樣品濃度有關(guān)的水平或垂直方向的熒光偏振光強度。通過熒光強度和樣品濃度制作工作曲線，就可以定量分析了，極大提高了方法的靈敏度和特異性。
熒光偏振 (FP) 檢測技術(shù)不需要分離游離和結(jié)合的示蹤物，減少了研究人員的工作量，所有檢測都可以在溶液中進行，具有快速、靈敏度高、特異性好、操作省時簡便的優(yōu)點。熒光偏振技術(shù)在 受體 /配體研究（如激素/受體檢測），蛋白質(zhì) /多肽相互作用，DNA/蛋白質(zhì)相互作用，酪氨酸激酶檢測，競爭性免疫檢測等分子互作技術(shù)中得以廣泛應(yīng)用。
◇ FP 檢測儀：
根據(jù)熒光偏振檢測和高通量篩選的需求，多功能酶標儀成為了 FP 檢測的理想儀器。高靈敏度熒光檢測模塊并配合熒光偏振檢測的專用配件，即可實現(xiàn) 96-1536 孔板的快速檢測，同時還可以配合疊板機來實現(xiàn)自動化高通量的檢測流程。
Agilent?BioTek?多功能微孔板檢測系統(tǒng)，功能強大應(yīng)用廣泛，作為部分功能模塊可以為用戶提供優(yōu)質(zhì)的熒光偏振檢測結(jié)果。上文中所有 FP 檢測結(jié)果均來自于 Agilent BioTek?Cytation5?多功能酶標儀。BioTek 也始終和中國科學家一起，共同為抗擊新冠，服務(wù)科研而不懈努力。
Cytation5多功能酶標儀
Agilent BioTek 可以給用戶提供一些列帶有高靈敏度熒光偏振檢測功能的多功能微孔板檢測產(chǎn)品，滿足不同用戶對實驗應(yīng)用的檢測需求。同時，我們還提供完備的自動化解決方案，最大限度的提高您的檢測通量和檢測效率。
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