TMT標記定量蛋白質組學可以表征生物系統中的全部蛋白質，目前已成為解決重要生物學問題的重要工具。然而，基于其技術方面的一些局限，目前仍面臨一定的挑戰，主要包括分析速度、蛋白質組覆蓋深度和定量的質量。

糖基化蛋白質組學

TMTpro 16plex標記試劑是Thermo Fisher Scientific新推出的新一代串聯質譜標簽，可實現一次標記16個樣本，既能提升多重樣品數量，又保證了蛋白檢測高通量和定量質量。以往TMT通量是標記11個樣本，但如果您的實驗設計是4組3重復，4組4重復或是5組3重復，那么該如何進行實驗設計？下面我們以4組3重復為例可采取如下方案：

方案1：分成3個標記組，并且增加3個內標“搭橋”，即增加3個混樣內標的標記上機。

A1、B1、C1、D1、內標

A2、B2、C2、D2、內標

A3、B3、C3、D3、內標

該方法需要3次質譜檢測，即降低了檢測速度同時又增加了檢測成本。

方案2：分成2個標記組，將一組樣本隨機分散在不同標記組中。 

A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2

C3、D1、D2、D3  

這種方法增加了數據重復性差的風險，并且也需要2次質譜檢測。

然而有了TMTpro 16plex這一切都不是問題，4組3重復？5組3重復？一次統統搞定，省時省力省錢！！！OMG，選它！選它！！選它！！！

2020年3月來自哈佛大學Steven P. Gygi研究組在Nature Methods上發表的題為“TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples”的研究論文，該文介紹了新一代串聯質譜標簽試劑TMTpro，既能提高樣品標記數量（它可實現一次同時標記16個樣品），又能保證蛋白鑒定高通量及質量，可有效解決上述存在的挑戰。下面讓我們具體來看一下TMTpro究竟具有哪些提升。

TMTpro試劑：一組同量異位標記質量標簽，可同時對16個樣品進行蛋白質組范圍的測定

作者首先利用人類細胞裂解物對TMTpro試劑和TMT試劑的蛋白定量能力進行了測試，TMTpro標記鑒定到的肽段數比TMT試劑略少，但TMTpro所需的碎裂能量更低，產生的報告離子信號更強。對于其他指標，包括標記效率、m/z的分布、MS2離子注入時間，SEQUEST得分、質量誤差和鑒定肽段的長度，二者之間基本相同。

為了研究TMTpro試劑和TMT試劑的定量精度，作者進一步利用SPS-MS3和hrMS2方法比較了HCT116細胞和293T細胞之間的蛋白質表達差異。研究發現二者具有高度相似的定量性能，并表現出很好的相關性。

圖1 TMT試劑和TMTpro試劑標記樣品的比較

作者使用TMTpro 16plex標記的樣品組研究使用和不使用Torin1處理的八種人類細胞系的蛋白差異表達情況，并結合實時搜索（RTS）方法，在每個重復平均定量了8800個蛋白質（每個蛋白質7.5個肽的平均值），整個蛋白質組分析的總數據采集時間為18 h，每個蛋白質組的分析時間僅為1.1 h。

圖2 TMTpro試劑在用Torin1處理的八種人類細胞系中的應用

作者一式五份用DMSO、1和20 μM星形孢菌素（一種廣譜激酶抑制劑）處理HCT116細胞裂解物，并進行了PISA分析。在常規TMT 10plex實驗中，需要以對照組作為實驗之間的橋梁來進行兩次TMT 10plex實驗。而使用TMTpro 試劑，可以在一個15plex實驗中容納對照組和兩個濃度組，從而減少了50％的處理和數據采集時間，并且在各個濃度下基本沒有缺失值。

圖3 TMTpro試劑在二維PISA分析中的應用

TMTpro試劑代表了進一步改進蛋白質組學中樣品多重化的強大起點。其中有幾個值得注意的優點：（1）蛋白質組檢測深度顯著，通過分餾分從細胞或組織中檢測蛋白通常超過8000個；（2）穩定的同位素標記直接支持多重化，同時提供高度準確的相對定量；（3）統計推斷可以在整個系統中得到更大的應用；（4）可以適用更復雜的實驗設計（例如可以在一個TMTpro實驗中安排更多數量的處理和重復實驗）。總之，新一代TMTpro將推動定量蛋白質組學技術達到前所未有的高通量和覆蓋深度。

TMTpro 16plex標簽同常規的TMT 6標、10標一樣，由三部分組成：分子量報告子、分子量標準化部分和反應基團。TMTpro 16plex試劑通過反應基團能夠高效地標記酶解后的肽段。在一級質譜圖中，分子量標準化部分使任何一種TMTpro 16plex試劑標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比。在串聯質譜中，可剪切臂能夠優先斷裂以便釋放分子量報告子。每個報告子都有各自獨特的分子量，并且能夠在MS/MS分析中反應出所標記的多肽的樣品豐度，根據報告離子的信號強度值可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。

TMTpro 16plex標簽結構示意圖